Как проводится сбор мочи для определения суточной потери белка. Причины повышения белка в моче

Множество заболеваний протекают без выраженных клинических проявлений, поэтому определение белка в моче с целью своевременного выявления и лечения патологического состояния является важным моментом для практической медицины.

Белок в моче может определяться качественными и количественными методами.

Качественные методы

На данный момент существует около 100 известных качественных реакций на белок. Они заключаются в осаждении протеина методом физических или химических воздействий. При положительной реакции происходит помутнение.

Наиболее информативными являются пробы:

С сульфосалициловой кислотой. Считается наиболее чувствительной и с ее помощью возможно определение даже самых незначительных количеств белковых тел в моче. Описание результата при следовом присутствии протеина обозначается термином «опалесценция», а при большем количестве - «слабо положительная», «положительная» и при большой потере белка с мочой - «сильно положительная реакция».
С заместителем кислоты - асептолом. В урину добавляется раствор вещества, и при образовании кольца на границе растворов, говорится о том, что проба является положительной.
Геллера. Производится при помощи раствора азотной кислоты. Итог проведения трактуется аналогично той, что с асептолом. Иногда кольцо может быть во время присутствия в исследуемой жидкости уратов.
С уксусной кислотой с добавлением селезистосинеродистого калия. При высокой концентрации мочи при проведении такой пробы, ее разбавляют, иначе может получиться ложноположительный результат, так как реакция будет на ураты и мочевую кислоту.

Неправильное проведение такой пробы часто может давать неверный результат у новорожденных детей, так как у них моча образуется с высоким содержанием мочевой кислоты.

Основные правила при проведении проб заключаются в следующем - необходимо, чтобы исследуемая моча была прозрачная, имела слабокислую среду (для этого иногда добавляют в нее небольшое количество уксусной кислоты), пробирок должно быть две для осуществления контроля.

Количественное определение

Когда проводится анализ мочи, общий белок определяется и количественными методами. Их достаточно много, но чаще всего применяются следующие:

Метод Эсбаха. Используется еще с 19 века. Для этого в определенную пробирку наливается моча и реактив. Потом смесь немного взбалтывают, и в закрытом виде оставляют на 24−48 часов. Полученный осадок считается по делению на пробирке. Правильный вывод можно сделать только при кислой моче. Такая методика достаточно проста, но не имеет высокой точности и требует затрат времени.
Метод Брандберга-Стольникова. Основан на пробе Геллера, которая позволяет получить результат при концентрации протеина более 3,3 мг%. Позднее такой способ был модифицирован и упрощен.
Широко используются нефелометрические методы установления количества белка.

Для полного понимания количества протеина, лучше всего использовать анализ мочи на суточный белок.

Для правильного результата первая утренняя порция выливается, сбор начинается со второй порции в одну емкость, которую рекомендуется держать в холодильнике.

Последняя порция собирается утром. После этого необходимо измерить объем, затем тщательно перемешать, и отлить в баночку порцию не более 50мл. Эту емкость и следует сдать в лабораторию. На специальном бланке требуется указать результаты общего объема суточной мочи, а также рост и вес пациента.

Применение тест-полосок

Тест на белок в моче действует по принципу индикаторов. Специальные полоски могут изменять свою окраску в зависимости от концентрации протеина. Они удобны для определения изменений, которые происходят в разное время, и применяются как в условиях дома, так и любых лечебных и профилактических учреждениях.Тест-полоски

Тестовые мочевые полоски используются при необходимости раннего определения и отслеживания результатов лечения при мочеполовых патологиях. Такая методика диагностики является чувствительной, и реагирует на альбумин в его концентрации от 0,1 г/л., и позволяет определить качественное и полуколичественное изменение содержания в моче белка.

По результатам этой диагностики можно контролировать эффективность терапии, вносит в нее поправки, и назначить необходимую диету.

26.02.2009

Куриляк О.А., к.б.н.

В норме белок выделяется с мочой в относительно небольшом количестве, обычно не более 100-150 мг/сут.

Суточный диурез у здорового человека составляет 1000-1500 мл/сут; таким образом, концентрация белка в физиологических условиях составляет 8-10 мг/дл (0,08-0,1 г/л).

Общий белок мочи представлен тремя основными фракциями - альбуминами, мукопротеинами и глобулинами.

Альбумин мочи - это та часть альбумина сыворотки крови, которая была профильтрована в клубочках и не была реабсорбирована в почечных канальцах; в норме экскреция альбумина в моче составляет менее 30 мг/сут. Иным главным источником белка в моче служат почечные канальцы, особенно дистальная часть канальцев. Эти канальцы секретируют две третьих общего количества мочевого белка; из этого количества примерно 50% представлено гликопротеидом Тамма‑Хорсфалла, который секретируется эпителием дистальных канальцев и играет важную роль в формировании мочевых камней. Иные белки присутствуют в моче в незначительном количестве и происходят из профильтровавшихся через почечный фильтр низкомолекулярных белков плазмы, которые не реабсорбируются в почечных канальцах, микроглобулинов из эпителия почечных канальцев (RTE), а также простатического и влагалищного отделяемого.

Протеинурия, то есть увеличение содержания белка в моче - один из наиболее значимых симптомов, отражающий поражение почек. Однако и целый ряд других состояний также может сопровождаться протеинурией. Поэтому различают две основные группы протеинурий: почечную (истинную) и внепочечную (ложную) протеинурию.

При почечной протеинурии белок проникает в мочу непосредственно из крови вследствие повышения проницаемости гломерулярного фильтра. Почечная протеинурия часто встречается при гломерулонефрите, нефрозе, пиелонефрите, нефросклерозе, амилоидозе почек, различных формах нефропатий, например нефропатии беременных, лихорадочных состояниях, гипертонической болезни и т.д. Протеинурия может обнаруживаться и у здоровых людей после тяжелых физических нагрузок, переохлаждения, психологического стресса. У новорожденных в первые недели жизни наблюдается физиологическая протеинурия, а при астении у детей и подростков в сочетании с быстрым ростом в возрасте 7-18 лет возможна ортостатическая протеинурия (в вертикальном положении тела).

При ложной (внепочечной) протеинурии источником белка в моче является примесь лейкоцитов, эритроцитов, клеток эпителия мочевых путей уротелия. Распад этих элементов, особенно резко выраженный при щелочной реакции мочи, приводит к попаданию белка в мочу, уже прошедшую почечный фильтр. Особенно высокую степень ложной протеинурии дает примесь крови в моче, при профузной гематурии она может достигать 30 г/л и более. Заболевания, которые могут сопровождаться внепочечной протеинурией - мочекаменная болезнь, туберкулез почки, опухоли почки или мочевых путей, циститы, пиелиты, простатиты, уретриты, вульвовагиниты.

Клиническая классификация включает легкую протеинурию (менее 0,5 г/сут.), умеренную (от 0,5 до 4 г/сут.), или тяжелую (более 4 г/сут.).

У большинства пациентов с заболеваниями почек, такими, как острый гломерулонефрит или пиелонефрит выявляют умеренную протеинурию, но больные с нефротическим синдромом обычно выделяют с мочой более 4 г белка ежедневно.

Для количественного определения белка применяется широкий спектр методов, в частности, унифицированный метод Брандберга-Робертса-Стольникова, биуретовый метод, метод с применением сульфосалициловой кислоты, методы с использованием красителя кумасси синий, красителя пирогаллоловый красный и др.

Использование различных методов определения белка в моче привело к тому, что в трактовке границ нормы содержания белка в моче возникла серьезная путаница. Поскольку наиболее часто в лабораториях используются 2 метода - с сульфосалициловой кислотой и красителем пирогаллоловый красный, рассмотрим проблему корректности границ норм именно для них. С позиции сульфосалицилового метода в нормальной моче содержание белка не должно превышать 0,03 г/л, с позиции же пирогаллолового - 0,1 г/л! Различия троекратные!!!

Низкие значения нормы концентрации белков в моче при использовании сульфосалицилового обусловлены следующими моментами:

калибровочная кривая строится по водному раствору альбумина. Моча по своему составу очень сильно отличается от воды: рН, соли, низкомолекулярные соединения (креатинин, мочевина и др). Вследствие этого по данным Альтшулера, Ракова и Ткачева ошибка определения белка в моче может быть 3-х кратной и более! Т.е. корректные результаты определения могут быть получены только в тех случаях, когда моча имеет очень низкий удельный вес и по своему составу и рН приближается к воде;
более высокая чувствительность сульфосалицилового метода к альбумину в сравнении с другими белками (в то время, как было упомянуто выше, альбумин в нормальных образцах мочи составляет не более 30% от общего белка мочи);
если pH мочи сдвинута в щелочную сторону, происходит нейтрализация сульфосалициловой кислоты, что так же является причиной занижения результатов определения белка;
скорость седиментации преципитатов подвержена значительной вариации - при невысоких концентрациях белка преципитация замедлена, и ранняя остановка реакции приводит к занижению результата;
скорость реакции преципитации существенно зависит от перемешивания реакционной смеси. При высоких концентрациях белка активное встряхивание пробирки может приводить к образованию крупных хлопьев и их быстрому осаждению.

Все выше перечисленные особенности метода и приводят к значительному занижению определяемой в моче концентрации белка. При этом степень занижения сильно зависит от состава конкретной пробы мочи. Поскольку метод сульфосалициловой кислоты дает заниженные значения концентрации белка то и граница нормы для этого метода 0,03 г/л тоже занижена примерно в три раза в сравнении с данными, которые приводятся в зарубежных справочниках по клинической лабораторной диагностике.

Подавляющее большинство лабораторий западных стран отказались от применения сульфосалицилового метода для определения концентрации белка в моче и активно используют для этих целей пирогаллоловый метод. Пирогаллоловый метод определения концентрации белка в моче и других биологических жидкостях основан на фотометрическом принципе измерения оптической плотности окрашенного комплекса, образующегося при взаимодействии молекул белка с молекулами комплекса красителя пирогаллоловый красный и молибдата натрия (Pyrogallol Red-Molybdate complex).

Почему пирогаллоловый метод позволяет получать более точные результаты измерения концентрации белка в моче? Во-первых, за счет большей кратности разведения пробы мочи в реакционной смеси. Если в сульфосалициловом методе отношение проба мочи/реагент составляет 1/3, то в пирогаллоловом методе оно может быть в пределах от 1/12,5 до 1/60 в зависимости от варианта методики, что значительно уменьшает влияние состава мочи на результат измерения. Во-вторых, реакция протекает в сукцинатном буфере, то есть при стабильном рН. И, наконец, сам принцип метода, можно сказать, более «прозрачный». Молибдат натрия и краситель пирогаллоловый красный образуют комплекс с молекулой белка. Это приводит к тому, что молекулы красителя в свободном состоянии не поглощающие свет на длине волны 600 нм в комплексе с белком свет поглощают. Таким образом, мы как бы метим каждую молекулу белка красителем и в результате получаем, что изменение оптической плотности реакционной смеси на длине волны 600 нм четко коррелирует с концентрацией белка в моче. Причем, поскольку сродство пирогаллолового красного к разным фракциям белка практически одинаковое, метод позволяет определять общий белок мочи. Поэтому граница нормальных значений концентрации белка в моче составляет 0,1 г/л (она и указана во всех современных западных руководствах по клинико-лабораторной диагностике, в том числе и в «Клиническом руководстве по лабораторным тестам», под ред. Н. Тица). Сравнительные характеристики пирогаллолового и сульфосалицилового методов определения белка в моче представлены в Таблице 1.

В заключение, хотелось бы еще раз акцентировать внимание на том факте, что при переходе лаборатории с сульфосалицилового метода определения белка в моче на пирогаллоловый метод граница нормальных значений существенно повышается (с 0,03 г/л до 0,1г/л!). Об этом сотрудники лаборатории должны непременно поставить в известность врачей-клиницистов, т.к. при сложившейся ситуации диагноз протеинурия может быть поставлен только в том случае, когда содержание белка в моче превышает 0,1 г/л.

Список литературы.

Альтшулер Б.Ю., Раков С.С., Ткачев Г.А. // Вопр. мед. химии. - 2001. - № 4. - C.426-438.
Ким Ю.В., Потехин О.Е., Токар М.И., Шибанов А.Н. // Лаб. мед. - 2003. - № 6. - C.94-98.
Клиническое руководство по лабораторным тестам, под ред. Н. Тица.- М.- Юнимед-пресс.-2003.- 942 с.
Козлов А.В., Слепышева В.В. Методы определения белка в моче: возможности и перспективы // Сборник трудов VII ежегод. СПб нефрол. семинара. - СПб: ТНА. - 1999. - C.17-28.
Пупкова В.И., Пикалов И.В., Хрыкина Е.Н., Харьковский А.В. // Новости «Вектор-Бест». - 2003. - № 4 (30).
Chambers R.E., Bullock D.G., Whicher J.T. // Ann. Clin. Biochem. - 1991. - Vol. 28 (Pt 5). - P.467-473.
Clinical Laboratury Medicine. Ed. by Kenneth D. McClatchey. - 2nd ed.-2001.- 1993p.
Eppel G.A., Nagy S., Jenkins M.A., Tudball R.N., Daskalakis M., Balazs N.D.H., Comper W.D. // Clin. Biochem. - 2000. - Vol. 33. - P.487-494.
Franke G., Salvati M., Sommer R.G. Composition and device for urinary protein assay and method of using the same // ПатентСША № 5326707. - 1994.
Kaplan I.V., Levinson S.S. // Clin. Chem. - 1999. - Vol. 45. - P.417-419.
Kashif W., Siddiqi N., Dincer H.E., Dincer A.P., Hirsch S. // Cleveland Clin. J. of Med. - 2003. - Vol. 70 (6). - P.535-547.
Koerbin G, Taylor L, Dutton J, Marshall K, Low P, Potter JM. // Clin. Chem. - 2001. - Vol. 47. - P.2183-2184.
Le Bricon T., Erlich D., Dussaucy M., Garnier J.P., Bousquet B. // Article in French. - Ann. Biol. Clin. (Paris). - 1998. - Vol. 56 (6). - P.719-723.
Marshall T., Williams K.M. // Clin. Chem. - 2003. - Vol. 49 (12). - P.2111-2112.
Pugia M., Newman D.J., Lott J.A., D’Mello L., Clark L., Profitt J.A., Cast T. // Clin. Chim. Acta. - 2002. - Vol. 326 (1-2). - P.177-183.
Ringsrud K.M., Linne J.J. Urinalysis and body fluids: A ColorText and Atlas // Mosby. - 1995. - P.52-54.
Shepard M.D., Penberthy L.A. // Clin. Chem. - 1987. - Vol. 33. - P.792-795.
Williams K.M., Marshall T. // J. Biochem. Biophys. Methods. - 2001. - Vol. 47. - P.197-207.
Williams K.M., Arthur S.J., Burrell G., Kelly F., Phillips D.W., Marshall T. // J. Biochem. Biophys. Methods. - 2003. - Vol. 57 (1). - P.45-55.

Если присутствует в моче повышенный уровень белка, то это может стать сигналом для обращения к доктору для обследования. Такую ситуацию нельзя оставлять без внимания, так как это может обернуться серьезными проблемами для человека.

Анализ мочи у ребенка или взрослого – один из типов проведения диагностики состояния их здоровья . Сдают такие тесты в разном возрасте, от ребенка до пенсионера. Общий анализ мочи у ребенка или взрослого поможет доктору вовремя выявить то или иное заболевание организма, правильно поставить диагноз и приписать требуемые препараты для лечения. При помощи общего анализа мочи можно выявить, какие процессы в организме происходят, а также то, как работают те или иные органы. При этом внимание уделяется наличию примесей в жидкости и ее цвету.

В том случае, когда доктору будет на 100% понятно , какое заболевание у пациента, то он может и не направлять того для сдачи общего анализа мочи. Это относится как к ребенку, так и к взрослому. Но бывают такие заболевания, диагностировать которые достаточно сложно. Тут также потребуется не только тестирование собранного материала, но и другие обследования. Это определяет врач, который и проводит лечение. Когда врач скажет, что пациенту требуется сдать общий анализ мочи, то тут следует придерживаться определенных правил сбора материала, а также гигиены. Такие правила и их соблюдение важны для постановки точного диагноза.

Моча является продуктом жизнедеятельности человека, которая выводится с организма естественным путем. На протяжении суток человеческий организм может выработать порядка 0.5-1.0 литра жидкости. Тут всё будет зависеть от того, сколько жидкости пил человек на протяжении всего дня, а также от приема определенных препаратов, например, мочегонного.

Моча может образовываться в почках в результате фильтрации крови. Далее она попада

ет в мочевик и выходит наружу. Если человек здоров, то такая жидкость будет прозрачной и без осадка. Тут также всё будет зависеть от того, какой образ жизни ведет тот или иной человек.

Чтобы определить количество белка в моче при сдаче общего анализа, следует сдать суточный сбор. Проводиться такое тестирование может как в амбулатории, так и в стационаре. После первого сбора на протяжении дня пациент должен через определенные промежутки времени собирать мочу для общего анализа.

Тут правила одинаковы как для ребенка, так и для взрослого. Проводить сбор следует на протяжении 24 часов. Предварительно обязательно стоит придерживаться правил сбора и личной гигиены. Также в такой период важно придерживаться определенной диеты. Тут уже стоит консультироваться с врачом, который и расскажет, какие продукты можно употреблять в пищу, а какие нет. Белок в общем анализе мочи можно выявить в лабораторных условиях.

Общий анализ мочи белок: показания

Чтобы проверить, повышена ли норма белка в сборе у ребенка или у взрослого, надо чтобы были определенные показания. Это могут быть такие, например:

Диабет.
Инфекция в почках или печени.
Сердечная недостаточность.
Панкреатит.
Миелома.
Опухоль в путях для испускания мочи.
Ожог.
Отравление.
Переохлаждение организма.

Повышенный белок в анализе мочи можно с точностью определить при проведении анализа на специальном оборудовании в лаборатории. Заниматься таким исследованием должен только специалист своего дела.

Также важна и симптоматика, перед тем, как проводить анализ мочи на белок. Анализ мочи на белок проводится в тех случаях, когда у человека выражена такая симптоматика:

Повышенное давление.
Рвота.
Боль в костях.
Потеря сознания.
Учащенное биение сердца.
Потеря сознания.
Тошнота.
Головокружение.

Также анализ мочи белок может проводиться в тех случаях, когда цвет мочи станет темноватым или красноватым. Это будет говорить о том, что у ребенка или у взрослого повышенная норма белка в организме. Если цвет собранного материала будет коричневым, то это скажет о заболевании печени.

Если в организме человека при общем обследовании и расшифровке результатов не обозначается повышенная норма белка, то это не всегда может говорить о том, что заболеваний в организме нет, так как обычно ярко выраженных симптомов на ранней стадии заболевания нет. Тут уже потребуется проводить дополнительные исследования, чтобы подтвердить или опровергнуть наличие таких заболеваний. Это свойственно как при расшифровке, так и при сдаче общего теста на норму или повышенный уровень белка в моче.

Специалисты по этой причине рекомендуют регулярно проводить тестирование на общую норму или повышенный белок. Также важно правильно при этом делать и расшифровку. Это поможет выявить заболевание на ранней стадии и вовремя начать лечение. В идеале человек должен сдавать сбор для выявления нормы или повышенного уровня белка в моче раз в год. Можно и чаще. Важна тут также и правильная расшифровка результатов. Потому расшифровку должен проводить опытный специалист.

Когда у человека появляется отечность, то это обычно свидетельствует о том, что в организме уменьшилась норма белка. Тут обязательно потребуется провести исследование мочи. Только это, а также грамотная консультация доктора поможет избавиться на ранней стадии от заболевания. Тут важно вовремя выявить такие симптомы, чтобы не произошло поражение и других органов тела.

При повышенном уровне белка в моче врач сможет диагностировать цистит, выявить камни в почках, а также определить склонность к простатиту. Если при сборе материала не соблюдать правила личной гигиены, а также рекомендаций врача, то можно в моче выявить повышенное количество белка. Такая ситуации возможно и не скажет про заболевание у человека, особенно, если у него нет жалоб на свое здоровье, а потому врач должен обязательно назначить дополнительное тестирование.

Также белок в моче определяется и в домашних условиях. Для этого в аптеке стоит купить тест-полоски. Если нет времени или возможности посетить больницу, но есть подозрения на повышенный белок в организме, то можно воспользоваться данными средствами. Это поможет почти верно выявить, повышено ли количество белка в теле. Но тут стоит помнить, что не всегда точность тестирования будет такой, как в лаборатории, а потому следует после проведения такого теста посетить врача и проконсультироваться.

Лечение: способы

В данном случае лечение зависит от тех причин, по которым белок появился в моче. Тут уже врач будет решать, как поступить с таким пациентом. Иногда может потребоваться повторное тестирование, особенно, если нет жалоб на здоровье, а также ранее не наблюдалось повышения уровня белка. Точный диагноз может поставить только опытный врач и назначить правильное лечение. Лечение обычно имеет симптоматический характер. При этом могут использоваться как обычные антибиотики, так и специальные препараты. В некоторых случаях от белка в моче можно избавиться и народными средствами.

Небольшое количество белка в суточной моче обнаруживается и у вполне здоровых лиц, однако такие небольшие концентрации не выявляют в разовых порциях используемыми в настоящее время методами. Приблизительно 70% белков мочи здорового человека приходится на долю уромукоида - белка, являющегося продуктом почечной ткани; таким образом, доля гломерулярного белка в моче здоровых людей является ничтожно малой и протеинурия в норме составляет 50-150 мг/сут, причем большинство белков мочи идентично сывороточным.

Принято различать следующие формы протеинурии в зависимости от места возникновения: преренальную, связанную с усиленным распадом белка тканей, выраженным гемолизом; ренальную, обусловленную патологией почек, которая может быть разделена на клубочковую и канальцевую; постренальную, связанную с патологией мочевыводящих путей и чаще всего обусловленную воспалительной экссудацией.

В зависимости от длительности существования выделяют постоянную протеинурию, существующую в течение многих недель и даже лет, и преходящую, появляющуюся периодически, иногда даже при отсутствии патологии почек, например при лихорадке и выраженной интоксикации. Целесообразно различать вариабельность протеинурии: при суточной потере белка до 1 г - умеренную, от 1 до 3 г - среднюю и более 3 г - выраженную.

Обнаружение в моче белков с относительно большой молекулярной массой свидетельствует об отсутствии избирательности почечного фильтра и выраженном его поражении. В этих случаях говорят о низкой селективности протеинурии. Поэтому в настоящее время широкое распространение получило определение белковых фракций мочи. Наиболее точны методы электрофореза в крахмальном и полиакриламидном геле.
По результатам, полученным этими методами, можно судить о селективности протеинурии.

Большинство качественных и количественных методов определения белка в моче основаны на его коагуляции в объеме мочи или на границе сред (мочи и кислоты); если есть способ измерить интенсивность коагуляции, то проба становится количественной.

Унифицированная проба с сульфосалициловой кислотой:

Необходимый реактив:

20%-ный раствор сульфосалициловой кислоты.

Ход исследования:

В 2 пробирки наливают по 3 мл профильтрованной мочи. В опытную пробирку прибавляют 6-8 капель реактива. На темном фоне сравнивают контрольную пробирку с опытной. Помутнение в опытной пробирке указывает на наличие белка, пробу считают положительной.

Если реакция мочи щелочная, то перед исследованием ее подкисляют 2-3 каплями 10%-ного раствора уксусной кислоты.

Унифицированный метод Брандберга-Робертса-Стольникова:

В основу метода положена кольцевая проба Геллера, заключающаяся в том, что на границе азотной кислоты и мочи при наличии белка происходит его коагуляция и появляется белое кольцо.

Необходимый реактив:

30%-ный раствор азотной кислоты (относительная плотность 1,2) или реактив Ларионовой.
Приготовление реактива Ларионовой: 20-30 г хлорида натрия растворяют при нагревании в 100 мл дистиллированной воды, дают остыть, фильтруют. К 99 мл фильтрата приливают 1 мл концентрированной азотной кислоты.

Ход исследования:

В пробирку наливают 1-2 мл азотной кислоты (или реактива Ларионовой) и осторожно, по стенке пробирки, наслаивают такое же количество профильтрованной мочи. Появление тонкого белого кольца на границе двух жидкостей между 2 и 3-й минутой указывает на наличие белка в концентрации примерно 0,033 г/л. Если кольцо появляется раньше 2 мин после наслаивания, мочу следует развести водой и провести повторное наслаивание уже разведенной мочи. Степень разведения мочи подбирают в зависимости от вида кольца, т.е. его ширины, компактности и времени появления. При нитевидном кольце, появившемся ранее 2 мин, мочу разводят в 2 раза, при широком - в 4 раза, при компактном - в 8 раз и т.д. Концентрацию белка при этом вычисляют путем умножения 0,033 на степень разведения и выражают в граммах на 1 л (г/л).

Иногда белое кольцо получается при наличии больших количеств уратов. В отличие от белкового кольца уратное появляется немного выше границы между двумя жидкостями и растворяется при легком нагревании.

Количественное определение белка в моче по помутнению, образующемуся при добавлении сульфосалициловой кислоты:

Принцип метода:

Интенсивность помутнения при коагуляции белка сульфосалициловой кислотой пропорциональна его концентрации.

Необходимые реактивы:

1. 3%-ный раствор сульфосалициловой кислоты.

2. 0,9%-ный раствор хлорида натрия.

3. Стандартный раствор альбумина - 1%-ный раствор (1 мл раствора, содержащий 10 мг альбумина): 1 г лиофилизированного альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки) растворяют в небольшом количестве 0,9%-ного раствора хлорида натрия в колбе вместимостью 100 мл, а затем доводят до метки тем же раствором. Реактив стабилизируют прибавлением 1 мл 5%-ного раствора азида натрия (NaN3). При хранении в холодильнике реактив годен в течение 2 месяцев.

Специальное оборудование - фотоэлектроколориметр.

Ход исследования:

В пробирку вносят 1,25 мл профильтрованной мочи, доливают до 5 мл 3%-ным раствором сульфосалициловой кислоты, перемешивают. Через 5 мин измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 590-650 нм (оранжевый или красный светофильтр) против контроля в кювете длиной оптического пути 5 мм. Контролем служит пробирка, в которой к 1,25 мл профильтрованной мочи долили до 5 мл 0,9%-ный раствор хлорида натрия. Расчет ведут по калибровочному графику, для построения которого из стандартного раствора готовят разведения, как указано в таблице.

Из каждого полученного раствора берут 1,25 мл и обрабатывают, как опытные пробы.

Прямолинейная зависимость при построении калибровочного графика сохраняется до 1 г/л. При более высоких концентрациях пробу следует разводить и учитывать разведение при расчете.

Ложноположительные результаты могут быть получены при наличии в моче контрастных веществ, содержащих органический йод. Поэтому тест нельзя использовать у лиц, принимающих препараты йода; ложноположительный результат может быть также обусловлен приемом сульфаниламидных препаратов, больших доз пенициллина и при высоких концентрациях в моче мочевой кислоты.

Биуретовый метод:

Принцип метода:

Пептидные связи белка с солями меди в щелочной с образуют комплекс фиолетового цвета. Белки предварительно осаждают трихлоруксусной кислотой.

Необходимые реактивы:

1. 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты.
2. 20%-ный раствор меди (CuSO4∙5H2O).
3. 3%-ный раствор NaOH.

Ход исследования:

К 5 мл мочи, взятой из суточного количества, прибавляют 3 мл раствора трихлоруксусной кислоты, центрифугируют до постоянного объема осадка. Надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, осадок затем растворяют в 5 мл раствора NaОН. К раствору добавляют 0,25 мл CuSO4, смесь перемешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость фотометрируют при длине волны 540 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм против дистиллированной воды. Концентрацию белка рассчитывают по калибровочной кривой, при построении которой на оси ординат откладывают концентрацию белка (г/л), а на оси абсцисс - оптическую плотность в единицах экстинкции. По полученной концентрации рассчитывают суточную потерю белка с мочой.

С помощью индикаторной бумаги (полосок):

Белок может быть обнаружен с помощью индикаторной бумаги (полосок), которые выпускаются фирмами “Albuphan”, “Ames” (Англия), “Albustix”, “Boehringer” (Германия), “Comburtest” и др.

Принцип основан на феномене так называемой протеиновой ошибки некоторых кислотно-щелочных индикаторов. Индикаторная часть бумаги пропитана тетрабромфеноловым синим и цитратным буфером. При увлажнении бумаги буфер растворяется и обеспечивает соответствующий рН для реакции индикатора.

При 3,0-3,5 аминогруппы белков реагируют с индикатором и меняют его первоначально желтую окраску на зеленовато-синюю, после чего, сравнивая с цветной шкалой, можно ориентировочно оценить концентрацию белка в исследуемой моче. Основной предпосылкой правильной работы индикаторных полосок является обеспечение pH в диапазоне 3,0-3,5 для протекания реакции.

Если бумага находится в контакте с исследуемой мочой дольше экспозиции, указанной в инструкции, то цитратный буфер в ней растворяется, и тогда индикатор реагирует на истинный рН мочи, т.е. дает ложноположительную реакцию. В связи с тем, что емкость буфера ограничена, то даже при соблюдении методических указаний в пробах слишком щелочной мочи (pH > 6,5) получаются ложноположительные результаты, а в пробах слишком кислой мочи (рН
Число реагирующих аминогрупп в составе отдельных белков различно, поэтому альбумины реагируют в 2 раза интенсивнее, чем такое же количество γ-глобулинов (белок Бенс-Джонса, парапротеины), и гораздо интенсивнее, чем гликопротеиды. Однако при большом количестве слизи с высоким содержанием гликопротеидов (при воспалении мочевыводящих путей) оседающие на индикаторной полоске хлопья слизи могут давать ложноположительные результаты.

Чувствительность отдельных производственных серий индикаторной бумаги, равно как и отдельных видов бумаги, выпускаемых одной и той же фирмой, может быть различной, поэтому к количественной оценке белка этим методом следует относиться осторожно. Определение суточной потери белков с мочой при помощи индикаторной бумаги невозможно. Таким образом, индикаторная бумага уступает химическим пробам, в первую очередь пробе с сульфосалициловой кислотой, хотя и дает возможность быстрого исследования серии образцов.

Обнаружение в моче белка Бенс-Джонса:

Белок Бенс-Джонса может выделяться с мочой при миеломной болезни, макроглобулинемии Вальденстрема.

Исследование целесообразно проводить только при положительной пробе с сульфосалициловой кислотой. Индикаторная бумага для обнаружения белка Бенс-Джонса непригодна.

Принцип:

Основан на реакции термопреципитации. Методы, с помощью которых оценивают растворение белка Бенс-Джонса при температуре 100 °С или повторное осаждение при последующем охлаждении, ненадежны, так как далеко не все белковые тела Бенс-Джонса обладают соответствующими свойствами. Наиболее достоверно выявление этого парапротеина осаждением его при температуре 40-60 °С, но и в этих условиях осаждение может не произойти в слишком кислой (рН 6,5) моче, при низкой относительной плотности мочи и при низкой концентрации белка Бенс-Джонса.

Необходимый реактивы:

2 М ацетатный буфер рН 4,9.

Ход исследования:

Профильтрованную мочу в количестве 4 мл смешивают с 1 мл буфера и согревают в течение 15 мин на водяной бане при температуре 56 °С. При наличии белков Бенс-Джонса уже в течение 2 мин появляется выраженный осадок, при концентрации белка Бенс-Джонса менее 3 г/л проба может получиться отрицательной. На практике это встречается крайне редко, так как большей частью концентрация белка Бенс-Джонса в моче значительная.

С полной достоверностью белок Бенс-Джонса может быть обнаружен иммуноэлектрофоретическим исследованием при использовании специфических сывороток против тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов.

Определение альбумоз (протеоз):

Альбумозы - это продукты расщепления белков, принцип определения которых основан на том, что они не сворачиваются при кипячении, но дают положительную биуретовую реакцию и высаливаются некоторыми солями, особенно сульфатом аммония и ацетатом цинка в кислой среде.

Нормальная моча альбумоз не содержит. Следы могут быть в нормальной моче в случае примеси семенной жидкости. В патологии альбумозы могут встречаться в моче при лихорадочных состояниях, переливании крови и плазмы, рассасывании экссудатов и транссудатов, распаде опухолей.

Необходимые реактивы:

1. Насыщенный раствор хлорида натрия.
2. Концентрированный раствор едкого натра.
3. Слабый раствор сульфата меди (почти бесцветный).

Ход исследования:

К моче, подкисленной уксусной кислотой, прибавляют насыщенный раствор хлорида натрия (1/3 объема), кипятят и горячую жидкость фильтруют. Альбумозы проходят в фильтрат, в котором их присутствие определяют биуретовой реакцией. К фильтрату прибавляют 1/2 объема концентрированного раствора едкого натра и несколько капель слабого раствора сульфата меди. При положительной пробе получается красно-фиолетовое окрашивание.

При положительной пробе с сульфосалициловой кислотой мочу нагревают. Если муть исчезает и вновь появляется при охлаждении, это означает, что моча содержит альбумозы или белковое тело Бенс-Джонса.

Белок в моче: методы определения

Патологическая протеинурия является одним из наиболее важных и постоянных признаков заболеваний почек и мочевых путей. Определение концентрации белка в моче является обязательным и важным элементом исследования мочи. Выявление и количественная оценка протеинурии важна не только в диагностике многих первичных и вторичных заболеваний почек, оценка изменения выраженности протеинурии в динамике несет информацию о течении патологического процесса, об эффективности проводимого лечения. Обнаружение белка в моче даже в следовых количествах должно настораживать в отношении возможного заболевания почек или мочевых путей и требует повторного анализа. Особо следует отметить бессмысленность исследования мочи и, в частности, определения белка мочи без соблюдения всех правил ее сбора .

Все методы определения белка в моче можно разделить на:

Качественные,

Полуколичественные,

Количественные.

Качественные методы

Все качественные пробы на белок в моче основаны на способности белков к денатурации под влиянием различных физических и химических факторов. При наличии белка в исследуемом образце мочи появляется либо помутнение, либо выпадение хлопьевидного осадка.

Условия определения белка в моче на основе реакции коагуляции:

Моча должна иметь кислую реакцию. Мочу щелочной реакции подкисляют несколькими (2 - 3) каплями уксусной кислоты (5 – 10%).

Моча должна быть прозрачной. Помутнение устраняется через бумажный фильтр. Если помутнение не исчезает, добавляют тальк или жженую магнезию (около 1 чайной ложки на 100 мл мочи), взбалтывают и фильтруют.

Качественную пробу следует проводить в двух пробирках, одна из них – контрольная.

Искать помутнение следует на черном фоне в проходящем свете.

К качественным методам определения белка в моче относятся:

кольцевая проба Геллера ,

проба с 15 – 20% сульфосалициловой кислотой ,

проба с кипячением, и другие.

Как показывают многочисленные исследования, ни один из большого числа известных методов качественного определения белка в моче не позволяет получать надежные и воспроизводимые результаты. Несмотря на это, в большинстве КДЛ в России эти методы широко используются в качестве скрининга – в моче с положительной качественной реакцией в дальнейшем проводят количественное определение белка. Из качественных реакций чаще используют пробу Геллера и пробу с сульфосалициловой кислотой, однако пробу с сульфосалициловой кислотой большей частью считают наиболее подходящей для выявления патологической протеинурии. Проба с кипячением в настоящее время практически не используется в связи с ее трудоемкостью и длительностью.

Полуколичественные методы

К полуколичественным методам относятся:

метод Брандберга-Робертса-Стольникова ,

определение белка в моче с помощью диагностических тест-полосок.

В основе метода Брандберга-Робертса-Стольникова лежит кольцевая проба Геллера, поэтому при данном методе наблюдаются те же ошибки, что и при пробе Геллера.

В настоящее время для определения белка в моче все чаще используются диагностические полоски. Для полуколичественного определения белка в моче на полоске в качестве индикатора чаще всего используется краситель бромфеноловый синий в цитратном буфере. О содержании белка в моче судят по интенсивности сине-зеленой окраски, развивающейся после контакта реакционной зоны с мочой. Результат оценивается визуально или с помощью анализаторов мочи. Несмотря на большую популярность и очевидные преимущества методов сухой химии (простота, скорость выполнения анализа) данные методы анализа мочи в целом и определения белка в частности не лишены серьезных недостатков. Одним из них, приводящих к искажению диагностической информации, является большая чувствительность индикатора бромфенолового синего к альбумину по сравнению с другими белками. В связи с этим, тест-полоски в основном приспособлены к обнаружению селективной гломерулярной протеинурии, когда практически весь белок мочи представлен альбумином. При прогрессировании изменений и переходе селективной гломерулярной протеинурии в неселективную (появление в моче глобулинов) результаты определения белка оказываются заниженными по сравнению с истинными значениями. Данный факт не дает возможности использовать данный метод определения белка в моче для оценки состояния почек (гломерулярного фильтра) в динамике. При тубулярной протеинурии результаты определения белка также оказываются заниженными. Определение белка с помощью диагностических полосок не является надежным индикатором низких уровней протеинурии (большинство выпускаемых в настоящее время диагностических полосок не обладают способностью улавливать белок в моче в концентрации ниже, чем 0,15 г/л). Отрицательные результаты определения белка на полосках не исключают присутствия в моче глобулинов, гемоглобина, уромукоида, белка Бенс-Джонса и других парапротеинов.

Хлопья слизи с высоким содержанием гликопротеидов (например, при воспалительных процессах в мочевых путях, пиурии, бактериурии) могут оседать на индикаторной зоне полоски и приводить к ложноположительным результатам. Ложноположительные результаты могут также быть связаны с высокой концентрацией мочевины . Плохое освещение и нарушение цветоощущения может быть причиной неточного результата.

В связи с этим, использование диагностических полосок следует ограничить скринирующими процедурами, а результаты, полученные с их помощью, следует рассматривать лишь как ориентировочные.

Количественные методы

Корректное количественное определение белка в моче в ряде случаев оказывается непростой задачей. Трудности ее решения определяются следующим рядом факторов:

присутствием в моче множества соединений, способных вмешиваться в ход химических реакций;

значительными колебаниями содержания и состава белков мочи при различных заболеваниях, затрудняющими выбор адекватного калибровочного материала.

В клинических лабораториях преимущественно применяются так называемые «рутинные» методы определения белка в моче, однако они далеко не всегда позволяют получать удовлетворительные результаты.

С точки зрения специалиста-аналитика, работающего в лаборатории, метод, предназначенный для количественного определения белка в моче, должен отвечать следующим требованиям:

обладать линейной зависимостью между поглощением образовавшегося в ходе химической реакции комплекса и содержанием белка в пробе в широком диапазоне концентраций, что позволит избежать дополнительных операций при подготовке пробы к исследованию;

должен быть прост, не требовать высокой квалификации исполнителя, выполняться при малом количестве операций;

обладать высокой чувствительностью, аналитической надежностью при использовании небольших объемов исследуемого материала;

быть устойчивым к воздействию различных факторов (колебаниям состава образца, присутствию лекарственных препаратов и др.);

обладать приемлемой стоимостью;

быть легко адаптируемым к автоанализаторам;

результат определения не должен зависеть от белкового состава исследуемого образца мочи.

Ни один из известных к настоящему времени методов количественного определения белка в моче не может в полной мере претендовать на роль «золотого стандарта».

Количественные методы определения белка в моче можно разделить на турбидиметрические и колориметрические.

Турбидиметрические методы

К турбидиметрическим методам относятся:

определение белка с сульфосалициловой кислотой (ССК),

определение белка с трихлоруксусной кислотой (ТХУ),

определение белка с бензетоний хлоридом.

Турбидиметрические методы основаны на снижении растворимости белков мочи вследствие образования суспензии взвешенных частиц под воздействием преципитирующих агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния, определяемого числом светорассеивающих частиц (нефелометрический метод анализа), либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа).

Величина светорассеяния в преципитационных методах обнаружения белка в моче зависит от множества факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения pH среды, присутствия посторонних соединений, способов фотометрии. Тщательное соблюдение условий реакции способствует образованию стабильной суспензии с постоянным размером взвешенных частиц и получению относительно воспроизводимых результатов.

Некоторые лекарственные препараты влияют на результаты турбидиметрических методов определения белка в моче, приводя к так называемым «ложноположительным», либо «ложноотрицательным» результатам. К ним относятся некоторые антибиотики (бензилпенициллин, клоксациллин и др.), рентгеноконтрастирующие йодсодержащие вещества, сульфаниламидные препараты.

Турбидиметрические методы плохо поддаются стандартизации, часто приводят к получению ошибочных результатов, но, несмотря на это, в настоящее время они широко используются в лабораториях из-за невысокой стоимости и доступности реактивов. Наиболее широко в России используется метод определения белка с сульфосалициловой кислотой.

Колориметрические методы

Наиболее чувствительными и точными являются колориметрические методы определения общего белка мочи, основанные на специфических цветных реакциях белков.

К ним относятся:

биуретовая реакция,

метод Лоури,

методы, основанные на способности различных красителей образовывать комплексы с белками:

Понсо S (Ponceau S),

Кумасси бриллиантовый синий (Coomassie Brilliant Blue)

пирогаллоловый красный (Pyrogallol Red).

С точки зрения исполнителя, в повседневной работе лаборатории при большом потоке исследований биуретовый метод является неудобным из-за большого числа операций. В то же время, метод характеризуется высокой аналитической надежностью, позволяет определять белок в широком диапазоне концентраций и выявлять альбумин, глобулины и парапротеины со сравнимой чувствительностью, вследствие чего биуретовый метод рассматривают в качестве референтного и рекомендуют для сравнения других аналитических методов обнаружения белка в моче. Биуретовый метод определения белка в моче предпочтительно выполнять в лабораториях, обслуживающих нефрологические отделения, и использовать в тех случаях, когда результаты определения с помощью других методов представляются сомнительными, а также для определения величины суточной потери белка у нефрологических больных.

Метод Лоури, обладающий более высокой чувствительностью по сравнению с биуретовым методом, сочетает биуретовую реакцию и реакцию Фолина на аминокислоты тирозин и триптофан в составе белковой молекулы. Несмотря на высокую чувствительность, данный метод не всегда обеспечивает получение надежных результатов при определении содержания белка в моче. Причиной тому служит неспецифическое взаимодействие реактива Фолина с небелковыми компонентами мочи (чаще всего аминокислотами, мочевой кислотой, углеводами). Отделение этих и других компонентов мочи путем диализа или осаждения белков позволяет с успехом использовать данный метод для количественного определения белка в моче. Некоторые лекарственные препараты – салицилаты, хлорпромазин, тетрациклины способны оказывать влияние на данный метод и извращать результаты исследования.

Достаточная чувствительность, хорошая воспроизводимость и простота определения белка по связыванию красителей делают эти методы перспективными, однако высокая стоимость реактивов препятствует более широкому их использованию в лабораториях. В настоящее время в России все большее распространение получает метод с пирогаллоловым красным.

Проводя исследование уровня протеинурии, нужно иметь ввиду, что различные методы определения протеинурии имеют разную чувствительность и специфичность к многочисленным белкам мочи.

Исходя из эмпирических данных, рекомендуется определять белок двумя разными методами и рассчитывать истинное значение по одной из приведенных формул: протеинурия = 0,4799 B + 0,5230 L; протеинурия = 1,5484 B – 0,4825 S; протеинурия = 0,2167 S + 0,7579 L; протеинурия = 1,0748 P – 0,0986 B; протеинурия = 1,0104 P – 0,0289 S; протеинурия = 0,8959 P + 0,0845 L; где B – результат измерения с Кумасси G-250; L - результат измерения с реактивом Лоури; P - результат измерения с молибдатом пирогаллола; S - результат измерения с сульфосалициловой кислотой.

Учитывая выраженные колебания уровня протеинурии в различное время суток, а также зависимость концентрации белка в моче от диуреза, различное его содержание в отдельных порциях мочи, в настоящее время при патологии почек принято оценивать выраженность протеинурии по суточной потере белка с мочой, то есть определять так называемую суточную протеинурию. Она выражается в г/сут.

При невозможности сбора суточной мочи рекомендуется определять в разовой порции мочи концентрации белка и креатинина. Поскольку скорость выделения креатинина в течение дня достаточно постоянна и не зависит от изменения скорости мочеотделения, отношение концентрации белка к концентрации креатинина постоянно. Данное отношение хорошо коррелирует с суточной экскрецией белка и, следовательно, может использоваться для оценки выраженности протеинурии. В норме отношение белок/креатинин должно быть менее 0,2. Белок и креатинин измеряют в г/л. Важным достоинством метода оценки выраженности протеинурии по соотношению белок-креатинин является полное исключение ошибок, связанных с невозможностью или неполным сбором суточной мочи.

Литература:

О. В. Новоселова, М. Б. Пятигорская, Ю. Е. Михайлов, "Клинические аспекты выявления и оценки протеинурии", Справочник заведующего КДЛ, № 1, январь 2007 г.

А. В. Козлов, "Протеинурия: методы ее выявления", лекция, Санкт-Петербург, СПбМАПО, 2000 г.

В. Л. Эмануэль, «Лабораторная диагностика заболеваний почек. Мочевой синдром», - Справочник заведующего КДЛ, № 12, декабрь 2006 г.

В.И. Пупкова, Л.М. Прасолова - Методы определения белка в моче (обзор литературных данных)

Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. Под ред. Е. А. Кост. Москва, "Медицина", 197